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CRISPR/Cas9
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CRISPR/Cas9 是一種能夠?qū)蚪M的特定位點(diǎn)進(jìn)行精確編輯的技術(shù)。其原理是核酸內(nèi)切酶Cas9蛋白通過導(dǎo)向性RNA（guide RNA, gRNA）識(shí)別特定基因組位點(diǎn)并對(duì)雙鏈DNA進(jìn)行切割，造成DNA雙鏈斷裂，細(xì)胞利用非同源末端連接(Non homologous End Joining，NHEJ）或者同源重組（Homologous Recombination, HR）方式對(duì)切割位點(diǎn)進(jìn)行修復(fù)，實(shí)現(xiàn)DNA水平基因敲除或精確編輯。
CRISPR/Cas9 系統(tǒng)主要由兩部分組成：
1. 單鏈的guide RNA（single-guide RNA，sgRNA）
2. 有核酸內(nèi)切酶活性的Cas9 蛋白
CRISPR基因敲除
以基因敲除為目的時(shí)，可以利用Cas9-sgRNA對(duì)DNA進(jìn)行切割產(chǎn)生雙鏈斷裂，隨后細(xì)胞通過非同源末端連接方式修復(fù)DNA，在此過程中，將隨機(jī)引入堿基的缺失或增加，基因發(fā)生移碼突變，導(dǎo)致編碼基因的敲除。
CRISPR基因編輯
以基因敲入或替換為目的時(shí)，需要借助同源重組原理。CRISPR/Cas9系統(tǒng)中的Cas9-sgRNA在靶位點(diǎn)進(jìn)行切割產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂，在模板DNA存在時(shí)，細(xì)胞通過同源重組方式修復(fù)DNA，而模板DNA可以被人為設(shè)計(jì)成需要插入的基因或需要修復(fù)的基因，此時(shí)細(xì)胞編碼目的基因。
載體的選擇（部分）
提供病毒載體的含Cas9蛋白的單載和雙載系統(tǒng)，可根據(jù)目的基因序列設(shè)計(jì)多條gRNA，載體帶有多種熒光抗性標(biāo)記，方便篩選。
載體類別 | 載體元件 |
CRISPR慢病毒單載體 | pLenti-U6-spgRNA v2.0-CMV-Puro-P2A-3xFLAG-spCas9-WPRE |
pLenti-U6-spgRNA v2.0-CMV-BSR-P2A-3xFLAG-spCas9-WPRE | |
pLenti-U6-spgRNA v2.0-CMV-sfGFP-P2A-3xFLAG-spCas9-WPRE | |
CRISPR慢病毒雙載體 | pLenti-U6-spgRNA v2.0-CMV-EGFP-WPRE |
pLenti-CMV-Puro-P2A-3xFLAG-espCas9_1.1-WPRE | |
CRISPR AAV單載體系統(tǒng) | pAAV-CMV-SaCas9-U6-sagRNA v2.0 |
pAAV-hSyn-SaCas9-U6-sagRNA v2.0 | |
CRISPR AAV雙載體系統(tǒng) | pAAV-CMV-EGFP-WPRE-U6-spgRNA v2.0 |
pAAV-U6-shRNA/spgRNA v2.0-CMV-EGFP-WPRE | |
pAAV-CMV-Luc2-WPRE-U6-spgRNA |
病毒載體服務(wù)流程
物種及目的基因名稱 Cas9病毒載體構(gòu)建 高滴度的病毒顆粒
病毒載體要求與選擇 病毒包裝與純化 按合同提供對(duì)照病毒
其它特殊需求 滴度測(cè)定 實(shí)驗(yàn)報(bào)告